ESTs, SAGE e RDA

1. Diferenças e similaridades entre ESTs e ORESTES
2. O fim de uma EST depende dos parâmetros de PHRED
3. Número de ESTs no dbEST hoje
4. Como descarregar ESTs
   NCBI - Search "Nucleotide" for:
   • Homo sapiens [organism] AND gbdiv_est [prop]
   • Maior grupo individual de seqüenciamento de ESTs humanas:
     Homo sapiens [organism] AND gbdiv_est [prop] AND ORESTES
   • Primeiras ESTs Brasileiras:
     Schistosoma mansoni [organism] AND gbdiv_est [prop] AND 1993 [pdat]
     (ou use "Limit" para limitar a consulta por data de publicação
5. Descarregue as ESTs de S. mansoni de 1993 e renomei para sm_ests_93. Transfira por SFTP (secure FTP) para biotec, conta lab, para um diretório com seu nome dentro da pasta "ests".
6. Uma opção para formar uniques a partir das ESTs é utilizar o programa tgicl que clusteriza as ESTs e posteriormente forma contigs com Cap3.
   A contagem de ESTs do mesmo cluster pode ser feita analisando-se o resultado de megablast
   Primeiro formate as ests com
   Separe somente aquelas comparações com alinhamento > 100:
   cat ../miguel/hsa_megablast | awk '$4 > 100 {print $0}' | more
   agora adicione um outro pipe para selecionar alinhamentos com mais de 96% de identidade
   cat ../miguel/hsa_megablast | awk '($4 >= 100 && $3 != "100.00") {print $0}'| more
   agora contearemos as repetições
   cat ../miguel/hsa_megablast | awk '($4 >= 100 && $3 != "100.00") {print $1}' | sort | uniq -c | sort -k 1,1 -n -r | more
   agora vamos recuperar a seqüência mais repetida com fastacmd
   fastacmd -s T14491.1 -d sm_ests_1993 -o seq32
   e vamos ver com quem ela alinha
   megablast -i seq32 -d sm_ests_1993 -e 1e-10 -o hits32 & agora inspecione o resultado hits32 e verifique a estrutura de DNA repetitivo desta seqüência.
7. Vamos agora verificar quantas dão hit contra a base de dados KOG
   blastall -i sm_ests_1993 -d /var/www/html/pct/db/kyva -e 1e-10 -p blastx -o sm_kog -m 8 &

• Selecione Homo sapiens
• Clique abaixo de Edit... A em "New..." e agora vc tem dois pools para comparar
• Clique em Edit... A e selecione ADULT BRAIN e todas as outras entradas de brain (mude a Description para BRAIN e Accept changes)
• Clique em Edit... B e selecione todas as bibliotecas de muscle e skeletal muscle (mude a Description para muscle e Accept changes)
• Verifique a expressão diferencial de alguma proteína (clique nela e dentro de seu report clique em Expression Profile.

• Entre em SAGE Anatomic Viewer
• Entre com o gene symbol da catalase "CAT" e veja a tag para catalase, mapeada em 3 fontes diferentes.
• Clique no homemzinho e nos outros símbolos e verifique a expressão diferencial em tecido normal e tumoral. Qual o número de Tags normal?
• Compare com a contagem feita pelo Unigene
• Compare com a contagem feita pelo K-EST
• É possível também, similarmente ao DDD, comparar a freqüência de SAGE Tags