1. Quais são
as duas formas principais nas quais um plasmídio
obtido de uma miniprep aparece em uma eletroforese em
gel de agarose? Como é possível sugerir que plasmídios diferentes possuem insertos diferentes a partir
da análise da eletroforese?
Resposta do
Grupo: Para se correr um gel contendo DNA plasmidial
são necessários vários procedimentos para o isolamento e purificação de uma
quantidade mínima do mesmo para se obter um resultado satisfatório. Nesse
processo podem ocorrer quebras da cadeia de DNA, de modo que a molécula não
mais se apresente na forma circular normalmente encontrada nas bactérias. Esse
fato pode levar a obtenção de duas bandas distintas em um gel, mesmo que os plasmídeos sejam idênticos e com insertos iguais. Isso
ocorre porque na conformação normal superespiralada,
o plasmídeo corre depressa no gel, enquanto que na
forma quebrada (porém não desnaturada), corre devagar.
Pode existir
também a possibilidade de que as bandas sejam formadas por plasmídeos
diferentes, com insertos de diferentes tamanhos. Porém isso só pode ser
confirmado através do tratamento do material com uma enzima de restrição e
solução desnaturante que linearize
todas as moléculas da amostra. Dessa forma, os diferentes insertos representam
pesos moleculares diferentes, podendo assim serem
separados em uma corrida em gel de agarose
2. O que
acontece com as duas formas do plasmídio relacionadas
na questão 1 quando o mesmo é digerido com uma enzima
de restrição que corte o plasmídio a 5’ (ou a 3’) do
inserto? Qual é a melhor maneira de determinar o PM dos diferentes plasmídios?
Resposta do
grupo: Quando plasmídeos são digeridos com uma enzima
de restrição, eles adquirem forma linear. A melhor maneira de se determinar o
peso molecular dos diferentes plasmídeos é colocá-los
para correr em gel de agarose. Após a clivagem da
molécula de DNA, os fragmentos podem ser separados por eletroforese horizontal
submersa em gel de agarose. A eletroforese separa as
moléculas submetidas a um campo elétrico, por sua carga, forma e tamanho.
Forma-se assim uma seqüência de bandas ao longo do gel, representando os
fragmentos de DNA de tamanhos distintos. Essas bandas podem então ser
visualizadas corando o DNA com Brometo de Etídio, que
provoca sua fluorescência quando observado à luz ultravioleta.
3. Quais
seriam as duas maneiras de isolar os insertos dos plasmídios?
Resposta do
grupo: Os insertos dos plasmídeos poderiam ser
isolados a partir de digestão com 1 ou mais enzimas de
restrição que cortem o DNA adjacente ao inserto, ou o mesmo poderia ser
amplificado através de PCR com os primers que anelam
no inserto ou com primers universais que anelam nas
regiões adjacentes no vetor. Através de
digestão com enzima de restrição, o inserto é retirado do vetor e através da
PCR o inserto é amplificado mas o vetor continua
contendo o fragmento
4. Digamos que
os insertos desses plasmídios representassem cDNA de Schistosoma mansoni adulto clonado nos plasmídios e que os insertos fossem seqüenciados parcialmente a
partir das extremidades apenas 1 vez. Que nome se dá a esse produto de seqüenciamento?
Resposta do grupo: São chamadas de EST ( etiqueta
de sequencias transcritas). Com essa seqüência podemos
comparar se a sequencia encontrada tem similaridade
com outra seqüência conhecia ou se a sequencia em
questão é um pedaço de um gene que ja foi descritro.
5. Determine o
número de ESTs dos
organismos abaixo presentes na data atual no GenBank:
Homo sapiens, Mus musculus, Oryza
sativa, Zea mays, Bos taurus,
Xenopus tropicalis, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Schistosoma mansoni. Use gbdiv_est [PROP] para delimitar a pesquisa.
Resposta do
Grupo:
Schistosoma mansoni: 158841
Caenorhabditis elegans: 346064
Drosophila melanogaster: 517542
Arabidopsis thaliana: 734275
Xenopus tropicalis: 1033269
Bos taurus: 1137353
Zea mays: 1160592
Oryza sativa: 1189821
Mus musculus: 4722075
Homo sapiens:
7895579
6. Compare o múmero de ESTs
com o número de entradas protéicas existentes para os organismos acima e
identifique projetos onde a caracterização de proteínas está atrasada com
relação ao número de ESTs geradas. O que acontece se
a pesquisa do número de entradas protéicas for limitada à base de dados RefSeq? Use a opção “Limits”: “only from” - “RefSeq”
do menu, ou diretamente srcdb_refseq[PROP].
Resposta do
Grupo:
Homo sapiens – EST: 7895579 / Protein: 314772/ RefSeq: 34025
Mus musculus – EST: 4722075 / Protein: 189283/ RefSeq: 44282
Oryza sativa – EST: 1189103/ Protein: 146255/ RefSeq:
27004
Zea mays – EST: 1160592/ Protein: 8964/ RefSeq: 318
Bos taurus – EST:
1137353/ Protein: 52612/ RefSeq: 30787
Xenopus tropicalis – EST: 1033269/ Protein: 12807/ RefSeq: 4700
Arabidopsis thaliana – EST: 734275/ Protein: 124988/ RefSeq: 30684
Drosophila melanogaster –
EST: 517542/ Protein: 77499/ RefSeq: 20071
Caenorhabditis elegans – EST: 346064/
Protein: 56432/ RefSeq: 23141
Schistosoma mansoni – EST: 158841/ Protein:
1299/ RefSeq: 12
Pode-se notar
que o número de proteínas é muito menor ao número de ESTs, já que ESTs, se
referem a pequenos fragmentos seqüenciados aleatoriamente, geralmente para
exercerem função de marcadores, e não aos mRnas
completos.. Quando limitada ao RefSeq,
ainda menos proteínas aparecem, pelo fato de o RefSeq
retirar da pesquisa os resultados redundantes.
7. Quais as
duas modalidades de BLAST que poderiam ser usadas para identificar ESTs de Homo sapiens
homólogas
a ESTs de Arabidopsis thaliana e qual delas seria mais eficiente? Considere
que ESTs são seqüências de nucleotídeos
e inclua em sua discussão a conservação evolutiva das regiões codificadoras versus a das seqüências de aminoácidos.
Resposta do Grupo:
As modalidades de BLAST mais cabíveis seriam BLASTn e tBLASTx, umas vez
que esses testes comparam duas seqüências de nucleotídeos, e as proteínas que
podem ser traduzidas pelos dois EST’s, respectivamente. O melhor teste seria o tBlastx, já que a comparação das
proteínas garante maior credibilidade ao resultado esperado, pois se trata de
regiões já codificadas. Quando se compara as seqüências de
nucleotídeos, as chances de se encontrar erros nas seqüências das EST’s
são muito maiores, o que dificulta a análise dos resultados, e, portanto, é
mais confiável utilizar uma seqüência sem íntrons
8. Utilizando
o site Taxonomy (NCBI), verifique como está
progredindo a caracterização 3D das proteínas dos organismos em questão.
Alternativamente, verifique quantas entradas existem em “Structure”
para esses organismos. Selecione uma entrada de cada organismo e gere uma
apresentação PowerPoint (use RasMol
e exporte GIF).
Façam suas
próprias!