BIOLOGIA MOLECULAR
GD1: ESTRUTURA DE ÁC. NUCLEICOS, REPLICAÇÃO, REPARO e TÉCNICAS DE CLONAGEM
1o. SEMESTRE 2004
1)- a-
Descreva a técnica de PCR, indicando todos os reagentes necessários para amplificar
um fragmento contendo a sequencia de um gene conhecido a partir do genoma de
uma célula.
b-
Descreva os procedimentos necessários para marcar o fragmento amplificado em (a)
através da incorporação de 32P nas extremidades cadeia
polinucleotídida. Indique todos os componentes da sua reação e como deve ser o
substrato radioativo que voce deve ser adicionado à reação.
2)- Suponha que o fragmento amplificado em (1a)
contenha sítios de EcoRI nas extremidades.
a- Descreva os procedimentos
necessários para clonar este fragmento no vetor de clonagem pBluescript,
incluindo etapas para aumentar a eficiência de clonagem e para identificação
visual de clones de bactérias que contenham o inserto clonado (indique o nome
de todas as enzimas que voce deverá utilizar).
b- Descreva em linha as etapas necessárias
(numerando-as) para que voce possa determinar a sequencia completa deste
fragmento, considerando que o tamanho deste é de 1,5 kb (indique o nome de
todas as enzimas que voce deverá utilizar).
3)- a- Cite três diferenças encontradas entre os
componentes e/ou estrutura nas moléculas de
DNA e RNA
b- Explique o que é o Tm de
uma molécula de DNA e como ele pode ser determinado sem o
conhecimento prévio da sua seqüência de bases.
c- Explique
por que para separar por eletroforese em gel de agarose moléculas de RNA de
tamanhos diferentes, é preciso que o gel seja desnaturante.
d- Explique
por que para separar por eletroforese em gel de agarose moléculas de DNA de
alto peso molecular, é preciso utilizar o método de Eletroforese em Campo
Pulsátil.
4)- Sobre a REPLICAÇÃO DE DNA, responda:
a- Durante
a síntese de DNA, uma das fitas é sintetizada de forma descontínua: por que?
b- Qual
é a fonte de energia para o processo?
c- Como
são sintetizados os primers.
5) a -Descreva (com um desenho esquemático)
a reação de do DNA, explicando porque a síntese só ocorre na direção 5’à 3’.
b- Descreva
(com um desenho esquemático) a atividade exonucleásica revisora 3’à 5’.
6)- Em relação as Técnicas de DNA recombinante,
responda:
a- O
que são Enzimas de Restrição e como elas podem ser utilizadas para a criação de
moléculas de DNA Recombinante?
b- O
que são plasmídeos e como eles podem ser utilizados para a criação de moléculas
de DNA Recombinante?
c- Cite
dois outros vetores de clonagem e em que situacões eles devem ser utilizados?
d- O
que é uma biblioteca gênica e como você faria para isolar um clone desta
biblioteca contendo um gene cujo produto é uma proteína para a qual voce tem um
anticorpo específico?
7)- Imagine que voce esteja interessado em estudar o
genoma de um microrganismo patogênico que produz uma toxina de 60 aminoácidos quando
em contato com células humanas. Descreva em linhas gerais os procedimentos
necessários para:
a- a
produção de uma biblioteca genômica deste microrganismo em bactérias.
b- Identificar
o gene que codifica essa toxina com base na sequencia dos 5 primeiros
aminoácidos da proteína.
c- Determinar
o tamanho do inserto contendo esse gene.
d- Identificar
e sequenciar a sequencia flanqueadora do gene que poderia conter os elementos
responsáveis pela regulação da expressão deste gene
8)- Examine a
dupla fita de DNA abaixo e responda:
3’GTG TTU TAC GAT 5’
a- Explique como a uracila pode
ter aparecido em uma das fitas.
b- Como esse tipo de mutação pode
ser corrigido? Descreva as duas atividades enzimáticas envolvidas nesse tipo de
reparo.
c- Se, logo após a replicação um nucleotídeo com erro de pareamento for introduzido, qual
o mecanismo que assegura o reparo dessa mutação?
d- Descreva o sistema de reparo
por excisão de nucleotídeos e como essa via pode reparar dímeros de timina.
e- Comente a possibilidade de
lesão ao DNA sem a exposição a agentes ambientais.