a)

Questão 1 - Um grupo de pesquisadores envolvidos em um projeto de vacina para toxoplasmose utiliza em seus experimentos adenovírus recombinantes para análise de resposta imune em camundongos Balb c. Para a produção desses vírus foram construídos plasmídeos com inserto de DNA exógeno contendo genes que codificam proteínas de superfície do T. gondii (sag 1, 2 e 3). Elabore um possível procedimento utilizado por esses pesquisadores para selecionar os vírus que contém o plasmídeo em seu interior.

Sugestão de resposta: Esses pesquisadores poderiam inserir no plasmídeo, além dos genes para proteínas de superfície do T gondii, um gene repórter, como por exemplo o gene da GFP. Sendo assim, as células que possuem os vírus com o plasmídeo de interesse em seu interior ficariam verdes em luz UV, facilitando a seleção dos vírus.

Perguntas adicionais:

- a apresentação do AUG correto das proteínas do T. gondii (sag 1, 2 e 3). será eficiente?

Questão 2 – Observe a seguinte seqüência- específica de bases do promotor de um gene hipotético de uma célula eucariótica.

Qual o procedimento poderia ser utilizado para purificar proteínas ligadoras a esse promotor?

Sugestão de resposta: Poderia ser utilizada a técnica de cromatografia de afinidade de DNA. Sendo assim, em uma primeira etapa utilizaria o extrato protéico total dessas células e passaria numa coluna com matriz contendo muitas seqüências diferentes de DNA. A lavagem em solução com baixa concentração de sal removeria as proteínas que não se ligam a DNA (a fraca afinidade por DNA não específico resulta de atrações iônicas, sendo as proteínas removidas por uma solução com uma concentração moderada de sal). Numa segunda etapa, passaria as proteínas ligadoras de DNA da etapa 1 em uma coluna com matriz contendo a seqüência do promotor em questão. Uma lavagem em uma solução com média concentração de sal remove todas as proteínas não específicas para o promotor. Uma lavagem com alta concentração de sal elui raras proteínas que reconhecem especificamente o promotor.

Perguntas adicionais:

- como verificar antes desse procedimento se a célula de onde as proteínas são extraídas contêm alguma proteína capaz de se ligar a um promotor contendo essa seqüência?

b) Purificação de uma proteína nativa

1- Quero purificar uma proteína de interesse da qual somente tenho a informação de que possui baixo Peso Molecular e que tem afinidade de ligação com glicose. Qual o(s) processos mais adequado(s) para purificar essa proteína de forma nativa? Justifique sua resposta explicando resumidamente o(s) método(s)?

R: Cromatografia de filtração em gel e Cromatografia por afinidade.

A primeira técnica é aplicada pois a proteína tem baixo peso molecular. A proteína será retida nos poros de resinas dentro da coluna da cromatografia, sendo que só irá sair da coluna apos certo tempo.

A segunda técnica é aplicada pois a proteína tem afinidade por glicose e, assim, ela irá se ligar aos grãos contendo radicais de glicose dentro da coluna. Para liberar a proteína da coluna adiciono uma solução concentrada de glicose, o que irá competir com os radicais de glicose dos grãos, liberando a proteína da coluna.

2- Para saber se uma proteína purificada está realmente pura, podem-se utilizar alguns processos. Cite um e explique resumidamente o processo de funcionamento.

R: Gel de poliacrilamida.

O gel é produzido e colocado numa cubeta contendo solução tampão e SDS. Uma alíquota da amostra purificada é colocada em uma canaleta do gel e uma outra alíquota contendo padrão de peso molecular é colocada em outra canaleta. Em seguida é induzida uma corrente elétrica que fará com que as proteínas se desloquem e se separem por diferença de tamanho, permitindo a comparação visual entre a banda formada no padrão e da amostra com a proteína. Assim é possível saber se a proteína de interesse foi realmente purificada.

Perguntas adicionais:

- como identificar rapidamente a proteína com precisão, supondo que seja uma proteína humana e esteja eluindo purificada?

c)

1. Como as sondas de hibridização podem ser usadas para identificar moléculas de DNA recombinantes contidas em colônias bacterianas?

As colônias bacterianas são transferidas para uma membrana de nitrocelulose ou nylon e então tratadas para remover todo o material contaminante, deixando apenas o DNA. Geralmente esse tratamento resulta também em desnaturação das moléculas de DNA de modo que as ligações de hidrogênio entre os filamentos individuais na dupla hélice são rompidas. Estas moléculas unifilamentares podem então ser fortemente ligadas à membrana por breve tratamento com calor ou por radiação com ultravioleta. As moléculas ficam ligadas à membrana por suas seqüências ose-fosfato, de modo que as bases ficam livres para se parear com moléculas complementares de ácido nucléico.

A sonda deve agora ser marcada, desnaturada pelo calor, e aplicada à membrana em uma solução de substâncias químicas que promovem a hibridização dos ácidos nucléicos. Após um período para permitir que ocorra a hibridização, a membrana é lavada, a fim de remover moléculas de sonda não ligadas, e postas para secar, e as posições da sonda ligadas são detectadas. A sonda é marcada com fósforo radioativo e as posições dos sinais de hibridização são vistas por auto-radiografia, na qual um filme sensível ao raio X é colocado sobre a membrana.

Perguntas adicionais:

- suponha que a sonda represente um promotor ativado por interferon. Que tipo de biblioteca deverá ser utilizada, genômica ou de cDNA, no experimento acima?

d)

1) Para identificar a expressão de um determinado gene em células eucarióticas, podemos detectar a produção de seu respectivo mRNA. Uma técnica possível para este objetivo é a PCR, que possui algumas variantes. Quais as principais diferenças entre uma RT-PCR e um PCR em tempo real? Quais as vantagens e desvantagens dessas duas técnicas?

Na RT-PCR utiliza-se o cDNA obtido a partir do RNA total através da enzima transcriptase reversa, o par de primers, um tampão com MgCl2, dNTPs, e a enzima Taq DNA polimerase. A amostra é então colocada em um termociclador com uma programação das temperaturas e ciclos a serem seguidos. Depois, para a visualização dos resultados é necessário fracionar a amostra em gel para fazer eletroforese. Já na PCR em tempo real, além do DNA e dos mesmos reagentes utilizados na RT-PCR, usa-se também um marcador. Isso ocorre porque o aparelho amplifica o DNA e ao mesmo tempo disponibiliza os resultados por um computador ligado à amostra, não sendo necessário fracionamento em gel. Na PCR em tempo real, não se verifica apenas a presença do segmento amplificado, mas obtém-se uma quantificação precisa. Portanto, a PCR em tempo real é mais vantajosa por ser mais rápida, por fornecer dados em maior quantidade e mais precisos e por diminuir a possibilidade de contaminação já que as amostras não precisam ser fracionadas para a visualização dos resultados. Uma desvantagem da PCR em tempo real em relação a RT-PCR é a dificuldade de padronização da técnica.

Perguntas adicionais:

- por quê na PCR de tempo real não se determina a quantidade de DNA amplificado após um número fixo de ciclos (digamos 30), mas determina-se o número de ciclos necessários para se produzir uma dada quantidade de DNA amplificado (digamos, 0,5 micrograma)?

2) Explique porque a técnica de cromatografia em colunas não seria muito eficiente para a detecção da produção da proteína do gene Fos e cite e descreva dois processos que seriam ideais para essa detecção.

A cromatografia em colunas não seria ideal porque não é prática para a detecção de pequenas amostras. Esse processo requer um volume maior da solução com a mistura de proteínas para que essa seja passada através de uma coluna contendo uma matriz sólida porosa. Então a proteína desejada irá interagir com a matriz sendo coletada durante a eluição. Portanto, os dois processos que seriam ideais para a detecção da proteína são o Western Blotting e o ELISA. O Western Blotting consiste na identificação de uma proteína específica após seu fracionamento em um gel, pela transferência dela para uma membrana de nitrocelulose e pela exposição dessa proteína a um anticorpo específico que tenha sido acoplado a um isótopo radioativo ou a um corante fluorescente. O método ELISA é muito parecido com o descrito anteriormente e consiste na identificação da proteína pela ligação de um anticorpo primário e de um anticorpo secundário que estará acoplado a uma enzima que mudará de cor ou irá se tornar fluorescente na leitura dos resultados. Porém, no método ELISA, diferentemente do Western Blotting, não se precisa da separação da proteína no gel e da transferência dessa proteína para uma membrana de nitrocelulose. No ELISA, a amostra contendo as proteínas é colocada diretamente nos wells/poços da placa, fazendo com que a proteína se adere ao fundo do poço. Após a adesão lava-se a placa para que se retire o excesso e então essa é bloqueada com outro componente, por exemplo a caseína, que evitará possíveis ligações cruzadas e erros de leitura.

Perguntas adicionais:

- uma importante confirmação de que se está realmente detectando a proteína correta e quantificando a produção da mesma com precisão é o PM dela. Discuta a vantagem do Western Blot sobre ELISA sob esse aspecto.

e)

1- Um aluno de iniciação científica do laboratório de biologia molecular recebeu a tarefa de produzir uma proteína recombinante em E.coli. O aluno seguiu corretamente o protocolo de clonagem em plasmídio e de transformação bacteriana, de modo que não houve qualquer falha na introdução do gene, composto apenas por exóns, que codifica a proteína desejada. Dois códons de Arginina, para os quais E.coli possui poucos transportadores foram substituídos por outros codons também de arginina, de forma a não influenciar na tradução. Entretanto não foi identificada a produção da proteína em questão. Aponte a falha cometida pelo aluno durante o processo e explique porque impossibilitou a tradução da proteína desejada.

R: O aluno não introduziu o sítio de ligação para o ribossomo, seqüência Shine -Dalgarno, que é essencial para o início da tradução procariota. A subunidade 30S do ribossomo liga-se no mRNA mensageiro somente neste ponto específico e percorre pelo mRNA até encontrar o códon de iniciação AUG, que está normalmente cerca de 10 nucleotídeos após o sítio de ligação, e inicia a tradução. Neste experimento a tradução foi impedida porque a subunidade 30S não pode se ligar no mRNA.

2- A primeira proteína humana a ser sintetizada por bactérias foi o hormônio anti-crescimento (somatotastina), importante no tratamento de diversos distúrbios do crescimento humano. Para isso, alguns detalhes tiveram que ser respeitados para que a E. coli pudesse traduzir o gene inserido como, por exemplo, a ligação desse gene logo após um promotor específico da bactéria. Cite pelo menos dois outros detalhes que devem ser observados para que possa ocorrer a tradução de uma proteína de um organismo superior em bactérias.

R: - Adicionar um sítio de ligação ao ribossomo da bactéria

- Retirar os íntrons do gene

- Utilizar códons preferenciais para as bactérias

- Adicionar a sequência Shine-delgarno

Perguntas adicionais:

- digamos que o stop codon escolhido pelo aluno seja UAG. Que resultado surpreendente ele obteria ao expressar o gene em bactérias utilizadas em biologia molecular que geralmente tem no genótipo a informação “SupE” ou “SupF”?

f)

1- Qual a importância do genoma na interpretação dos resultados do MALDI-TOF?

R.:O genoma vai determinar qual a proteína precisamente analisando-se os resultados da espectometria de massa.

2- Como a técnica de footprinting é capaz de determinar a presença de proteínas ligadas ao promotor?

R.:Através de PCR, amplifica-se a região do promotor, e para sua visualização, o DNA é marcado em uma extremidade com fosfato radioativo. O produto então é misturado a um extrato de protéinas do núcleo, juntamente com DNAse, que vai cortar os fragmentos em inúmeras partes. Em um gel de poliacrilamida, serão observadas as bandas referentes aos vários locais onde a noclease cortou. Na presença de proteína acoplada ao promotor, a DNAse não vai conseguir cortar, e então será observado um espaço em branco no gel, uma interrupção no padrão de bandas.

Perguntas adicionais:

- é possível acelerar o descobrimento da proteína cujo peso molecular foi precisamente determinado no MALDI-TOF ao se tratar de uma proteína de ornitorrinco?