Lunapark foi observado na busca de elementos regulatórios de Hox.

É conservado mas não se sabe a função da proteína.

É expresso no limbo e vesículas genitais como Evx e genes Hoxd.

O gene repórter beta-geo foi clonado como repórter tendo um aceptor de splicing à montante e inserido no primeiro intron de lunapark, numa ES cell, que foi injetada em blastocistos, originando quimeras.

As quimeras foram coradas pra detecção da expressão. Não é preciso fazer o transgênico completo pois só se quer ver o local da expressão na própria quimera.

Limo e vesículas genitais estavam coradas. Também havia um sinal no sistema nervoso central em desenvolvimento.

Os 3 genes devem compartilhar acentuadores...

Lunapark foi expresso também em outros tecidos, mas estes sempre expressavam um ou dois dos outros genes, como cérebro anterior, olhos e coração.

Em galinhas a expressão é semelhante e colocalizada com Hoxd genes.

Em tetrápodas o alcande do acentuador é maior, cerca de 150 kb, mas os genes não precisam ser relacionados na função celular (se bem que eles não sabem a função do lunapark)

Não adianta inserir como trnasgene o cluster Hoxd, portanto o acentuador não fica dentro do domínio.

Usaram um BAC que contém de lunapad a Hoxd11, inserindo beta-gal em Hoxd11.

O reporter expressou no "trunk", pois o Hoxd11 expressa ali, mas não houve expressão nos dígitos. Só um sinal nos limbos escondidos, mas ali até um transgene só de Hoxd11 expressa.

Com uma sonda específica para Hoxd13, analisaram outros animais. Houve uma expressão na vesícula caudal, mas não no limbo. A sonda era específica para o transgene humano.

Então a localização do acentuador dos dígitos deve estar mais para o centrômero.

Partiu-se para a captura de acentuador: um gene lacZ sob o controle do promotor mínimo de beta-globina. Para inserí-lo em lugares aleatórios foi adaptado o trnasposon Tn7. Foi feito "in vitro" e em média somente uma inserção por BAC ocorreu.

Mais de 95% dos genes construídos não tinham rearranjos e mais de 80% tinham apenas uma inserção. Ela ocorria em média a cada 10 kb, randomicamente, dentre os 175 kb do BAC.

Os BACs eram humanos porque há uma forte SINTENIA. Assim, isso ajudava a poder monitorar a presença e integridade do inserto humano. Vários BACs foram usados, para cobrir uma extensão de 700 kb da região.

Nem todos foram injetados, uma pré-análise selecionou os mais interessantes para cobrir a região.

O primeiro experimento foi feito com o repórter perto de Hoxd9 e não houve expressão no limbo. Logo, a abordagem poderia detectar o acentuador com especificidade.

A construção betaLac6 aparentemente estava próxima do acentuador.

Foram feitos camundongos transgênicos. Tudo parecia OK, exceto pelo padrão de expressão de Hoxd13, pois este não é expresso em alguns lugares.

Com o uso de BACs parcialmente sobrepostos, foi inferido que o acentuador estaria numa região de 100 kb exclusiva do BAC #504o20.

Recortaram metade da parte centromérica desse BAC, restando a metade telomérica onde o repórter estava e ele foi testado. Assim, o acentuador ficou contido em 54 kb.

Atividade neural: foi identificada principalmente na captura de enhancer. Também coincide com a expressão de Evx2. Alguns casos foram reportados onde transgenes tinham sido inseridos a montante de Evx2 e exibiram expressão neural. Logo esse acentuador é pouco específico para promotores e regula Lnp e EVx2.

Mas a regulação neural não ocorria em outro BAC, indicando que os acentuadores neurais estão próximos mas não coincidentes.

Por causa da sintenia foi possível procurar por sequencias conservadas entre homem e camundongo na região mapeada. Depois da comparação foi tentada uma deleção de 40 kb. Isso nocauteou a expressão no limbo. Também a expressão neural foi perdida. Ainda havia expressão no coração e olhos.

GCR é mais que LCR pois regula genes de lugares diferentes.

Olha que o nível de conservação da região é enorme. Será que ele ocorreria em teloósteos, onde não há dígitos? Fugu tem lunapark e alguns Hox. Nesses peixes o locus é 5 a 7 vezes menor. E não é que o GCR está lá? Somente as regiões conservadas em mamíferos, os blocos principais, foram mantidos. Como a parte interna aos dois blocos sumiu, ele passou de 40 para 6 kb nos peixes.

Vamos testar em camundongos? A expressão dorsal ficou boa! Mas a expressão límbica não aconteceu.

A comparação detectou uma forte homologia entre peixe e mamífero concentrada numa região de 5 kb, que foi deletada na construção humana. Ficou tudo igual...

A mutação Ulnaless no heterozigoto causa ausência de ulma, o que sugere alelismo com HoxD. No mutante, Hoxd13 e 12 são superexpressos em zeu gopodos e perda de expressão nos dígitos. A porção 5' de lunapark revelou polimorfismos, sugerindo inserções na unidade transcrita entre os exons 3 e 4 de lnp. Aparentemente Ul é uma inversão balanceada do cromossomo 2, com uma quebra centromérica dentro de lnp e uma quebra telomérica 770 kb a juzante. A inversão pegou Evx2, HoxD e Mtx2.

Cruzaram fêmeas Ul com machos sem a região, para ficar em heterozigozepois o duplo semidominante é ruim. Analisaram Hoxd13 e Evx2 (que estavam invertidos com relação ao GCR). Isso fez a expressão neural ser perdida. Também a límbica. Quando posicionados a mais de 700 kb do GCR, não funcionam.