A clonagem gênica permitiu um avanço explosivo no conhecimento nas áreas biológicas. Clonagem significa a obtenção de múltiplas cópias de um gene para que se possa manipulá-lo quimicamente. A clonagem biológica de um gene consiste em inserí-lo em um vetor, que é um DNA capaz de se multiplicar dentro de um sistema vivo; um exemplo é o plasmídio bacteriano. Sendo que uma colônia de bactérias é proveniente de uma só célula, portanto um clone, e cada bactéria carrega múltiplas cópias do plasmídio que por sua vez carrega o gene clonado inserido em si, quando se faz uma MINIPREP de um plasmídio obtém-se então suficiente número de cópias desse gene para manipulações químicas. Este é o objetivo desta prática.

A lise alcalina é um dos procedimentos mais usados para a extração rápida de plasmídios bacterianos. Ela envolve o uso das soluções I, II e III e subsequente precipitação do DNA plasmidiano com ácool isopropílico, para concentrá-lo. A solução I contém apenas tampão (TrisHCl), um quelante de Mg++ e Ca++ (para impedir seu uso como ativador de DNase) e glicose. A solução II é ativa na lise e contém NaOH e um agente de solvatação SDS (dodecilsulfato de sódio). Com a ação da solução II as proteínas sofrem desnaturação parcial e o SDS liga-se a elas misturando sua cadeia alifática ao cerne hidrofóbico das proteínas semi-desnaturadas. O DNA da bactéria não se desliga das proteínas semidesnaturadas e é alvo de precipitação pela ação da solução III, que contém K+. O sal de K+ do SDS precipita prontamente, levando consigo o DNA bacteriano e deixando o plasmídio no sobrenadante. Este último é precipitado mudando-se a constante dielétrica do meio com álcool; isto pode ser feito com o uso de 1 volume de isopropanol ou com 2 volumes de etanol. Opcionalmente, antes desta precipitação, pode-se fazer uma extração com solvente orgânico; neste caso mistura-se igual volume de fenol:clorofórmio:álcool isoalílico na proporção 25:24:1 ou mesmo clorofórmio:álcool isoamílico 24:1. Centrifuga-se para separar a fase orgânica (inferior) da fase aquosa (superior) e retira-se esta última com cuidado para não coletar as proteínas desnaturadas pelo fenol que estarão contidas na interface da mistura.

Préviamente inoculou-se, com um único toque de alça de platina em uma colônia bacteriana, 5 ml de meio de cultura chamado LB acrescido do antibiótico seletivo para o plasmídio utilizado (ampicilina). Como o plasmídio produz uma enzima degradadora do antibiótico, a presença do antibiótico garante que somente bactérias contendo o plasmídio possam crescer neste meio. Incuba-se por cerca de 16 horas. Para a prática, recebemos o tubo de cultura pré-crescida de um clone bacteriano.

1. Transferir 1,5 ml da cultura para um tubo de microcentrífuga e centrifugar por 1 min (basta preencher o tubo com cuidado). Mantenha o tubo da cultura no gelo. Transfira o sobrenadante da centrifugação para o frasco de descarte e observe o sedimento representado por células bacterianas. Aumente o sedimento acrescentando mais 1,5 ml de cultura ao mesmo tudo e centrifugue novamente. Descarte novamente o sobrenadante e examine novamente as bactérias sedimentadas que serão utilizadas na extração plasmidiana.

5. Centrifugue por 5 min

8. Centrifugue o DNA plasmidiano por mais 5 min e retire cuidadosamente o sobrenadante com micropipeta.

12. Revelar o DNA plasmidiano obtido por iluminação com luz ultravioleta. O gel contém brometo de etídio. O etídio intercala-se entre os pares de base do DNA e, intercalado, fluoresce no vermelho, enquanto fluoresce no amarelo quando livre. Assim, observa-se o DNA com uma coloração alaranjada.

13. Procure distinguir o RNA à frente, a banda de DNA plasmidiano superespiralizado e, muito possivelmente, uma banda de migração de DNA plasmidiano na forma de círculo relaxado, sem superespiralização, gerado por quebras mecânicas comuns ao procedimento que desfazem a superespiralização encontrada no DNA biológico. Superespiralização é a espiral do eixo da dupla-hélice, introduzida em bactérias pela Girase e de função biológica pois pode ser usada para neutralizar a espiral do DNA e facilitar a abertura das fitas.

A Escherichia coli é uma bactéria haplóide contendo um único cromossomo circular lilgado à membrana plasmática. Essa molécula de DNA mede cerca de 1,36 mm que é uma centena de vezes maior que o diâmetro da bactéria. Sendo assim, este apresenta-se necessariamente em uma forma compacta.

Os plasmídios presentes naturalmente em bactérias podem ser usados para carregar genes clonados. Para purificar o plasmídio de uma bactéria é primeiramente necessário separá-lo do cromossomo bacteriano. O protocolo de lise alcalina permite essa separação porque o cromossomo bacteriano está significativamente mais associado a proteínas que vão precipitar com o sal potássico do SDS.

Na segunda parte, o DNA plasmidiano purificado é concentrado por precipitação com 2 volumes de etanol absoluto ou 1 volume de isopropanol. O sedimento contém sais que podem ser retirados com uma lavagem do sedimento agitando-se o mesmo em etanol 70%. A isso dá-se o nome de lavagem do sedimento, uma vez que o DNA não pode ser solubilizado em etanol. O DNA é ressuspendido em tampão apropriado TrisHCl 10 mM EDTA 1 mM; a função do tris é manter o pH e do EDTA quelar Mg++ e Ca++, necessários para a ação de enzimas degradadoras de DNA, portanto o mesmo fica protegido. A função do tampão de amostra é aumentar a viscosidade dela (contém glicerol), adicionar cor para que possa ser aplicado e permitir o monitoramento da corrida eletroforética pois o corante é ngativo, migrando para o pólo vermelho (positivo).

A situação natural desse DNA é estar superespiralizado in vivo. Essa forma é chamada de forma I e migra rapidamente no gel. Quebras mecânicas inevitáveis a essa manipulação fazem parte dos plasmídios perderem a superespiralização, gerando a forma II, que migra lentamente no gel. Uma terceira forma, que dá a informação exata do tamanho molecular do plasmídio, a forma III, só pode ser obtida por linearização do mesmo com uma enzima de restrição que corta o DNA num ponto específico. Todavia, a migração da forma III pode ser imaginada entre a das formas I e III.

As enzimas de restrição, que cortam o DNA especificamente, são utilizadas para separar o gene clonado do plasmídio e ambos fragmentos podem ser separados um do outro por eletroforese similar a essa que realizamos. Quando fragmentos muito pequenos precisam ser separados, utilizamos gel de agarose mais concentrado. Chegamos a usar até a concentração de 2% para poder distinguir fragmentos de 200 pb.

O que é clonagem gênica? Dê um exemplo

Como um plasmídio pode ser purificado?

Como se garante que as bactérias cultivadas contêm o plasmídio?

Quais são as formas de migração de um plasmídio em gel de agarose?

O RNA é purificado conjuntamente com o plasmídio. Como poderíamos eliminá-lo após a purificação?

Para que pólo migra o etídio numa eletroforese e o que aconteceria com as bandas de DNA pequeno caso a eletroforese durasse muito?

Utilizando as enzimas de restrição, como podemos saber se o plasmídio que purificamos é realmente aquele que queríamos obter?

Como podemos confirmar, da mesma forma, que o gene clonado é aquele que gostaríamos de estudar e não um gene que alguém nos passou por engano?