Treinamento em Bioinformática 2008

Usando dbEST para construir Unigene

Contigs de ESTs:

Descarregue as ESTs de txid3483 (Search: EST for txid3483), mande para a maracatu e renomeie como cs.est. Conte elas.
Dê uma limpadinha com $seqclean cs.est. Conte elas limpas!
Crie um diretório tgicl e copie cs.est.clean para lá e rode $tgicl cs.est.clean (vai demorar um pouco)
Examine cs.est.clean_clusters
Entre em asm_1 e conte os contigs com $cat contigs | grep “>” –c. Conte também os singlets.
Quer uma forma de mapear a clusterização na mão? $megablast –i contigs –d cs.est –D 3 –b 1000000000 –H 1 –F F –a 4 –s 100 –p 95–o contar
E depois $cat contar | awk ‘{print $1}’ | sort | uniq -c
Vamos deixar anotando com uniprot_not_frag usando:

$blastall –p blastx –i contigs –d /home/treinamento/db/uniprot_not_frag –m 9 –b 5 –a 4 –e 1e-10 –o saída &

Inspecionando o Unigene na Web

Tem txid3483 lá? Ou o número de ESTs ainda é pequeno?
O Unigene é fonte organizada de bibliotecas. Na página inicial, clique em Sacharum officinarum e explore Library Browser.
Abra o registro da biblioteca de meristema Lib 12027. Faça o download das seqüências. Descarregue uma biblioteca de raiz Lib 12047.
Abra a de meristema $vi lib12027, substitua > por >meristema assim “:%/>/>meristema/g” e também faça a substituição no caso da raiz
Para casa: Junte ambas com cat lib12027 lib12047 e rode um TGICL. Inspecione os singlets. Inspecione tb os clusters para saber se são mistos.
Vamos olhar algum gene? nanog AND Mus musculus [organism] >>> Mm6047
Tem muita coisa legal na página de um Unigene mas nada como “Expression Profile”
Compare com o Unigene humano Hs.544577. Olhe em adult quantas ESTs há por cada milhão!
Vamos ouvir a estória do Hs.447330

DDD: Digital Differential Display by Unigene e a estorinha do Hs.447330

· Selecione Homo sapiens e aperte o botão [Continue]

· Edite new pool para BRAIN e selecione todas as entradas de brain. Clique [Continue]

· Agora edite o pool B para HEART e selecione todas as bibliotecas de HEART e [Continue]

· Verifique a expressão diferencial dos primeiros clusters (clique nele e dentro de seu ”report” clique em Expression Profile)

Unigene Local

· Ta cheio de uso local? Faça um BLAST no NCBI desta EST e descubra o Unigene dela (Hs.2).

· É mas tem hora que não tem jeito. Veja a área de FTP do Unigene. Entre em Homo sapiens. Faça o download de Hs.seq.uniq.gz com wget e descompacte com gunzip arquivo. Este arquivo está formatado em /home/treinamento/db. Vc pode agora fazer um BLAST da EST e descobrir o Unigene dela!!!

SAGE

É um método de documentação de tags de mRNA constituídas das bases subseqüentes (um número pequeno, cerca de dezenas) ao último sítio de uma dada enzima de restrição.

· Entre em SAGE Anatomic Viewer

· Entre com o gene symbol da catalase "CAT" e veja a tag para catalase, mapeada em 3 fontes diferentes.

· Outra possibilidade é entrar com o identificador Unigene, exemplo Hs.25647

· Clique no hominho e nos outros símbolos e verifique a expressão diferencial em tecido normal e tumoral.

· Qual o número de Tags normal para a catalase? Compare com a contagem feita pelo Unigene.

· É possível também, similarmente ao DDD, comparar a freqüência de SAGE Tags e fazer download das Tags

PSI-BLAST:

More linha_psi: $/usr/local/BLAST/blast-2.2.17/bin/blastpgp -i fosfogliceromutase_Ecoli -d hsa.pdb -e 10 -h 1e-5 -j 10 -a 4 -o saida.glicoecoli.pdb -m 9 &
Onde –h controla o E-value para participar da próxima iteração, -j o número de iterações
Agora vamos buscar ORESTES (nt) usando uma matriz pssm criada contra o nr, em duas etapas:
$blastpgp -i fosfogliceromutase_Ecoli -d nr -h 1e-5 -j 10 -a 4 -o saida.nr -m 8 –C matriz.chk &
$blastall –p psitblastn –i fosfogliceromutase_Ecoli –d hsa.ORESTES –e 1e-10 –a 4 –m 8 –R matriz.chk –o saída.pssm &

Compare com: $blastall –p tblastn –i fosfogliceromutase_Ecoli –d ORESTES.hsa –e 1e-10 –a 4 –m 8 –o saída.blosum &

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