Identificação de variantes de SARS-Cov-2

Escolha sua amostra

• Dentre as amostras abaixo, escolha a sua e copie para sua pasta

• Entre na sua pasta e crie um diretório SARS e entre nele

cd eusoujacu
mkdir SARS
cd SARS

• Copie a amostra para sua pasta exportando a variável AMOSTRA, assim sempre que usar $AMOSTRA, o computador vai entender o código da sua:

export AMOSTRA="AMOSTRA_ESCOLHIDA" #Substitua o conteúdo entre aspas pelo código da amostra da tabela que escolheu
cp /home/bioufmg/micromamba/bak/SARS/input/$AMOSTRA*.fastq.gz .

Ative o ambiente do tipo conda mais novo (micromamba) chamado SARS

micromamba activate SARS

Controle de qualidade

• Trimmomatic vai retirar as regiões de baixa qualidade, remover os adaptadores e filtrar sequências curtas. Dando um ls repare como usando $AMOSTRA vc completa o nome do arquivo R1 e R2 com a variável exportada que tem o código da sua.

trimmomatic PE -threads 20 $AMOSTRA\_L001_R1_001.fastq.gz $AMOSTRA\_L001_R2_001.fastq.gz Paired_R1.fastq.gz Unpaired_R1.fastq.gz Paired_R2.fastq.gz Unpaired_R2.fastq.gz ILLUMINACLIP:/home/bioufmg/micromamba/bak/SARS/adapters.fasta:2:30:10:2:keepBothReads LEADING:5 TRAILING:5 SLIDINGWINDOW:4:20 MINLEN:50

Mapeamento ao genoma de referência

• Mapeia os reads em um genoma de referência de SARS-Cov-2 (RefSeq.fasta) com o BWA criando um alinhamento múltiplo no formato binário "bam" ("sam" daria pra ler, "bam" só computador lê). Vamos usar somente as saídas "Paired" do Trimmomatic, os reads R1 e R2 que produziram forward e reverse.

bwa mem /home/bioufmg/micromamba/bak/SARS/reference/RefSeq.fasta Paired_R1.fastq.gz Paired_R2.fastq.gz -o map.bam

Ordenar o mapeamento e Empilhar as sequências

• samtools que tb trabalha com "bam" vai anotar a ordem de posicionamento dos reads com sort e vai empilhá-los com mpileup para criar um alinhamento múltiplo pile.bam com as reads na posição referente ao vírus

samtools sort map.bam -o map.sorted.bam
samtools mpileup -d 50000 --reference /home/bioufmg/micromamba/bak/SARS/reference/RefSeq.fasta -a -Q 30 map.sorted.bam > pile.bam

Identificação de variações genéticas

• Compara as sequências do alinhamento múltiplo com o genoma referência e identifica pontos de mutação com ivar (ative este ambiente)

micromamba activate ivar
cat pile.bam | ivar variants -p variant -q 30 -t 0.05 -r /home/bioufmg/micromamba/bak/SARS/reference/RefSeq.fasta -g /home/bioufmg/micromamba/bak/SARS/reference/RefSeq.gff
cat pile.bam | ivar consensus -p variant -q 30 -t 0.05 -m 30 -n N

Sequencia do virus da amostra quando não se sabe o vírus - pular para Identificação de variantes

Montagem do genoma viral com spades

• Faz a montagem do genoma viral orientado pela referência RefSeq. Reative o ambiente SARS.

micromamba activate SARS
spades.py --only-assembler --trusted-contigs /home/bioufmg/micromamba/bak/SARS/reference/RefSeq.fasta -1 Paired_R1.fastq.gz -2 Paired_R2.fastq.gz -t 20 -o assembly

Filtragem de fragmentos de montagem

• Remove scaffolds pequenos que não representam o genoma do virus e cria o input para o pangolin

cat assembly/scaffolds.fasta | grep ">" | less

cat assembly/scaffolds.fasta | perl /home/bioufmg/micromamba/bak/SARS/filter_small.pl 20000 > pangolin_input.fasta

Identicação de variante de SARS-Cov-2

• Ative o ambiente pangolin

micromamba activate pangolin

pangolin variant.fa
cat lineage_report.csv | awk -F "," '{print $2"\t"$4"\t"$5}'