Identificação de variantes de SARS-Cov-2
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- Dentre as amostras abaixo, escolha a sua e copie para sua pasta
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45_S45 |
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| 47_S47 |
48_S48 |
49_S49 |
4_S4 |
cd ~/eusoujacu
mkdir SARS
cd SARS
export AMOSTRA="AMOSTRA_ESCOLHIDA"
cp /home/bioufmg2/anaconda3/bak/SARS/input/$AMOSTRA*.fastq.gz .
Entre no ambiente conda
conda activate SARS
Controle de qualidade
- Trimmomatic vai retirar as regiões de baixa qualidade, remover os adaptadores e filtrar sequências curtas.
trimmomatic PE -threads 20 $AMOSTRA\_L001_R1_001.fastq.gz $AMOSTRA\_L001_R2_001.fastq.gz Paired_R1.fastq.gz Unpaired_R1.fastq.gz Paired_R2.fastq.gz Unpaired_R2.fastq.gz ILLUMINACLIP:/home/bioufmg2/anaconda3/bak/SARS/adapters.fasta:2:30:10:2:keepBothReads LEADING:5 TRAILING:5 SLIDINGWINDOW:4:20 MINLEN:50
Mapeamento ao genoma de referência
- Mapeia os reads filtrados em um genoma de referência de SARS-Cov-2 formatado para o BWA
bwa mem /home/bioufmg2/anaconda3/bak/SARS/reference/RefSeq.fasta Paired_R1.fastq.gz Paired_R2.fastq.gz -o map.bam
Ordenar o mapeamento e Empilhar as sequências
samtools sort map.bam -o map.sorted.bam
samtools mpileup -d 50000 --reference /home/bioufmg2/anaconda3/bak/SARS/reference/RefSeq.fasta -a -Q 30 map.sorted.bam > pile.bam
Identificação de variações genéticas
- Compara as sequências do mapeamento com a referência e identifica pontos de mutação
conda activate ivar
cat pile.bam | ivar variants -p variant -q 30 -t 0.05 -r /home/bioufmg2/anaconda3/bak/SARS/reference/RefSeq.fasta -g /home/bioufmg2/anaconda3/bak/SARS/reference/RefSeq.gff
cat pile.bam | ivar consensus -p variant -q 30 -t 0.05 -m 30 -n N
Bônus
Montagem do genoma viral
- Faz a montagem do genoma viral orientado pela referência já depositada
conda activate SARS
spades.py --only-assembler --trusted-contigs /home/bioufmg2/anaconda3/bak/SARS/reference/RefSeq.fasta -1 Paired_R1.fastq.gz -2 Paired_R2.fastq.gz -t 20 -o assembly
Filtragem de fragmentos
- Remove contigs pequenos que não representam o genoma do virus
cat assembly/scaffolds.fasta | perl /home/bioufmg2/anaconda3/bak/SARS/filter_small.pl 20000 > pangolin_input.fasta
Faz identicação de variante de SARS-Cov-2
conda activate pangolin
pangolin <(cat variant.fa pangolin_input.fasta)
cat lineage_report.csv | awk -F "," '{print $2"\t"$4"\t"$5}'